高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn);進樣系統(tǒng)要求進樣便利切換嚴密;由于液體流動相粘度遠遠高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小于氣相色譜柱。HPLC應用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。
高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
1、樣品準備：樣品準備對HPLC分析結(jié)果至關重要。確保樣品純凈，并根據(jù)所需分離目標選擇適當?shù)奶崛?、凈化和濃縮方法。
2、色譜柱選擇：根據(jù)需要分離的化合物特性選擇合適的色譜柱。考慮分離機理、柱填料類型、柱尺寸和固定相親水/疏水性等因素。
3、流動相選擇：根據(jù)待分離物的極性選擇合適的流動相組合。優(yōu)化溶劑體系，平衡分辨率和保留時間。
4、校準曲線：為了定量分析，建立準確的校準曲線并進行適當?shù)尿炞C。使用已知濃度的標準品制備一系列濃度點，并確定響應因子或檢測靈敏度。
5、進樣方法：選擇適當?shù)倪M樣方法，如自動進樣器或手動進樣。確保進樣量恒定且符合儀器要求。
6、溫度控制：一些分析可能需要在特定溫度下進行。使用恒溫箱或列溫控制器確保色譜柱處于穩(wěn)定的溫度條件下。
7、檢測器設置：根據(jù)目標化合物的特性選擇合適的檢測器。常見的檢測器包括紫外-可見光譜檢測器（UV-Vis）、熒光檢測器、電化學檢測器等。
8、數(shù)據(jù)分析：正確解釋和分析HPLC數(shù)據(jù)是確保準確結(jié)果的關鍵。使用合適的軟件進行峰識別、積分和定量計算。
9、儀器維護：定期進行儀器維護和校準，包括清洗色譜柱、更換流動相溶劑和檢查液壓系統(tǒng)等。
